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叶绿体中的光合作用将光能转化为化学能，吸收二氧化碳，释放氧气，是地球生物圈的重要塑造者。叶绿体约在15亿年前通过蓝藻内共生进化而来。在进化过程中，叶绿体基因要么被废弃，要么逐渐转移到细胞核染色体中，导致多数陆地植物叶绿体基因组只保留了110-130个基因。其中，大部分基因编码基因转录、蛋白翻译和光合作用组分。叶绿体基因组保存着两种类型的RNA聚合酶，即细菌型质体编码的RNA聚合酶（PEP）和噬菌体型核编码的RNA聚合酶（NEP）。叶绿体PEP在原始质体发育过程中起到重要作用，并作为主要的RNA聚合酶在成熟的叶绿体中转录80%的叶绿体基因。PEP核心（PEP core）保留了细菌RNA聚合酶类型的结构，包括2个α亚基、1个β亚基、1个β'1亚基和1个β'2亚基，但不含ω亚基，整体分子量约为450 kDa。PEP的特点是若干细胞核编码真核起源的PEP相关蛋白（PAPs）与PEP core紧密相互作用，并组装成一个分子量约为1 MDa的超复合物。每个PAP突变表型与PEP core亚基突变体类似，表现出白化/苍白等叶绿体发育缺陷表型。尽管大量工作探究了叶绿体PEP的组成和功能，但真核起源的PAPs如何与和细菌起源的PEP core进行复合物组装，以及如何调控PEP的转录活性，这些问题尚未得到解答。3月1日，澳门赌场分子植物科学卓越创新中心张余团队和华中农业大学周菲团队合作，在《细胞》（Cell）上发表了题为Cryo-EM structures of the plant plastid-encoded RNA polymerase的封面研究论文。该团队基于叶绿体转化技术，建立了烟草叶片中纯化内源PEP的方法，解析了叶绿体RNA聚合酶PEP复合物和PEP转录延伸复合物的高分辨率冷冻电镜结构，揭示了叶绿体基因转录机器的亚基组成、亚基组装方式、特殊功能和功能适应性演化，并为进一步探讨叶绿体中转录调控的机制和功能奠定了结构基础。为了纯化内源性烟草PEP超大复合物，该研究构建了转基因叶烟草，在叶绿体基因组rpoC2基因的3'端插入了一个编码串联His-Flag标签的DNA片段。进一步，研究利用30-45的天转基因烟草叶子，进行亲和、离子交换和分子排阻层析等步骤纯化，最终得到高纯度的PEP超大复合物，且具有转录催化活性。PEP结构显示PAP12的结合位置与蓝藻RNA聚合酶的ω亚基相同，且一级序列和三维结构高度保守，表明PEP包含一个完整的细菌来源RNA聚合酶，构成了PEP的“催化模块”。此外，15个真核起源的PAPs结合在PEP core外围，组成不同的功能模块，包括“支架模块”、“保护模块”、“RNA模块”和“调控模块”。这是目前已知最复杂的基因转录机器。“支架模块”由七个亚基（PAP1、PAP3、PAP5、PAP7、PAP8、PAP11和PAP14）组成。“支架模块”与PEP的相互作用界面较大，约占的PEP core表面一半以上，并与PEP core形成多个亚基间结构域，不仅稳定“催化模块”而且为其他模块提供结合支架。“保护模块”由Fe-SOD异源二聚体组成，包含PAP4和PAP9两个亚基（又称FSD3和FSD2）。“保护模块”通过超氧化物歧化酶功能，保护PEP免受叶绿体中超氧化物攻击。“RNA模块”由单个亚基PAP2组成，结合在RNA合成通道外围，以序列特异性的方式结合RNA，参与并协助RNA转录后加工。“调控模块”由四个亚基PAP6、PAP13和两个PAP10（又称FLN1、FLN2和Trx z）组成，参与保护“催化模块”α亚基的C端结构域，可能参与调控PEP的转录活性。这些功能模块均由细胞核基因组编码，在细胞质中被翻译后转运到叶绿体与PEP的催化模块形成复合物，实现细胞核对叶绿体基因表达的控制。该研究对PEP-PAP蛋白亚基进化分析发现，叶绿体基因转录机器PEP-PAP的演化时间与植物登陆时间基本一致，以及陆生植物叶绿体基因转录机器通过招募这些额外的亚基，演化出独特的功能和调控机制，帮助其适应陆地环境和特殊的生命周期。在基础研究层面，该成果为进一步探索叶绿体基因转录机器的工作模式、探索叶绿体的基因表达调控方式以及改造叶绿体基因表达调控网络打下了基础。在合成生物学应用层面，该研究为提升植物叶绿体生物反应器的效率提供了着手点，有望助力重组疫苗、重组蛋白药物和天然产物的生产。在“双碳”目标下，该工作为光合作用系统基因表达水平的提高提供了新思路，将助力植物高效碳汇。研究工作得到国家重点研发计划、澳门赌场战略性先导科技专项（B类）和上海市基础研究特区计划的支持。论文链接叶绿体基因转录蛋白质机器构造《细胞》封面